Mozartovy koule to nebyly, ty se dají koupit i u nás. Letos se ale v tomto okouzlujícím městě konala 38. konference Rakouské společnosti pro hygienu, mikrobiologii a preventivní lékařství, na které je většina přednášek v němčině a účastnický poplatek je dosti vysoký, takže se na něm čeští účastníci prakticky nevyskytují. Proto možná stojí za to napsat alespoň krátce, co mě na mítinku nejvíc zaujalo (kromě přátelské, vyloženě rodinné atmosféry). Byla to přednáška o celogenomovém sekvenování ze vzorku krve pacienta, což možná teď u leckoho vyvolá povzdech "zase tyhle chiméry, za kterými se honí velká věda, místo a pomohla vylepšit rutinní diagnostiku" - ale přitom právě o to v přednášce šlo, takže nezavěšujte prosím a čtěte dál.
Nejdříve stručná rekapitulace současného stavu - k novince se dostanu až nakonec. Pravdou je, že po stažení SeptiFastu (Roche) z trhu to vypadalo, že klasická hemokultura zůstane ještě dlouho zlatým standardem detekce původců sepse, přestože není superrychlá a její cca 30% citlivost také není ideální. V poslední době to ale začalo na trhu "vařit", objevily se systémy T2 a Qvella, které nevyžadují hemokultivaci a detekují vybrané patogeny přímo z krve v den odběru. Oba systémy jsou založeny na selektivním zakoncentrování nukleových kyselin bakterií a u obou následuje specifická PCR-amplifikace. která z podstaty věci může být zaměřená jen na omezený počet druhů. Výběr je samozřejmě zaměřen na nejčastější a nejvýznamnější patogeny, přesto jde oproti hemokultuře o určitou slabinu - nové technologie jsou rychlé, ale jen pro patogeny, na které cílí. U nich by měly být také citlivější než hemokultivace, ale ve zbytku spektra původců selhávají. Koho zajímají technické detaily, o technologii T2 jsme už psali zde, Qvella se liší v tom, že je amplifikace zaměřena na RNA, podrobnosti na stránkách firmy zde. Z praktického pohledu mají společné to, že jde o jednoúčelové stroje, které nejsou levné, stejně jako nebudou levné detekční cartridge.
A teď konečně k té novince - nejde o hotový komerční produkt, ale leccos slibného k němu už bylo publikováno a hlavně přednáška byla podána tak, že jsem i já velmi rychle pochopil, v čem je přelomovost nového přístupu a proč by se mohl v rychlé detekci bakteriální sepse vysněným kamenem mudrců - pokud tedy v praxi dostojí teoretickým předpokladům. Nejde o detekci DNA nebo RNA extrahované z jednotlivých buněk bakterií, které se v krvi při sepsi mohou nalézat, ale o detekci tzv. volné plazmatické DNA (bakteriální nebo houbové). Tato DNA může být extrahována z plazmy po separaci od buněk (lidských erytrocvytů, leukocytů, takže se sníží "pozadí" lidské DNA) a po přípravě knihovny přímo sekvenována. První námitka, která každého napadne, je velké nebezpečí falešných pozitivit - při obyčejném čištění zubů se přece do oběhu translokují nejen bakterie, ale i jejich DNA, stejný proces probíhá např. přes střevní sliznici, která je narušena chermoterapií. Při vývoji metody bylo ale prokázáno, že takto uvolněná DNA je velmi rychle degradována nukleázami, takže proces uvolňování bakteriální nebo houbové DNA musí být signifikantní, aby byl detekován. S detekcí volné plazmatické DNA jsou přitom již dobré zkušenosti např. při neinvazivní diagnostice vrozených genetických vad plodu z krve matky - tady také dochází k translokaci DNA plodu do krve matky, DNA lze sekvenovat a vyhnout se tak rizikové amniocentéze.
A třešnička na dortu na závěr - těm, kdo si ještě pamatují způsob organizace DNA, se vybaví obrázek vlákna DNA, obtočeného 2,5-otáčkami kolem komplexu histonových bílkovin (obrázek např. zde). "Nahá" DNA mezi histony je v krvi degradována DNázami prakticky okamžitě, déle zůstává zachována pouze DNA obtočená kolem komplexu histonů. Ta je pak sekvenována. V krvi je ale samozřejmě i lidská DNA, uspořádaná podobným způsobem. A na to se mj. (předtím, než je rozpadem buněk do plazmy uvolněna) vážou transkripční faktory řídící zapínání konkrétních genů v konkrétním fyziologickém stavu buň a organismu. Tyto transkripční faktory vytvářejí také bílkovinné komplexy (obrázek např. zde) a chrání tak tzv. promotor (regulační sekvenci konkrétního genu) před degradací DNázami podobně jako histony.
A v čem je tedy ten vtip? Sekvenací volné plazmatické DNA můžeme získat informaci nejen (1) o přítomnosti útržků bakteriální nebo houbové DNA v krvi, ale i (2) o genech, které v lidských buňkách organismuis v daném okamžiku zapíná a - BINGO - mezi nimi se vyskytují i geny specifiucky zapínané v septickém stavu. Takže se skutečně rýsuje kámen mudrců, který by s citlivostí větší než hemokultura a navíc v den odběru dokázal říct, jestli se v krvi pacienta vyskytuje DNA patogena v situaci, kdy na to organismus reaguje septicky. Navíc technika bude schopna zároveň detekovat expresi charakteristickou minimálně pro některé typy rakoviny, takže dokáže v diferenciální diagnóze i vyloučit nebo naopak detekovat paraneoplastické stavy. Dalším bonusem by mělo být, že nebude potřeba jednoúčelový stroj - přístroj pro sekvenování nové generace může být v core-facility nemocnice využíván pro velký rozsah dalších diagnostických úkonů, "pouze" je potřeba vyčlenit část kapacity pro statimové zpracování extraktů z plazmy.
P.S. O tématu přednášel Dr. Kai Sohn z Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik IGB, hlavní publikace k aplikacím v mikrobiologii zde a zde.
P.P.S. Fotka je z terasy restaurace M32 na Mönchbergu (nenápadně skrytá v budově Muzea moderního umění), kam lze buď vyšlápnout, nebo vyjet výtahem ze 3 Eura. Přestože bylo zataženo a podvečer, výhled na toto okouzlující město byl famózní, vřele doporučuji.
Comments